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KOD DNA聚合酶是从克隆有Thermococcus Kodakaraensis DNA聚合酶基因的质粒在大肠杆菌中经诱导表达分离纯化而来。该酶所具有的超强3'→ 5'外切酶活性使得其扩增保真性比Pfu DNA Polymerase更高，保真性是Taq的约50倍，同时具有合成速度快的特点，聚合速度约为普通Pfu DNA Polymerase的5倍，Taq DNA Polymerase的2倍，达到100～138bp/秒，可以在短时间内获得高产量的扩增产物，特别适合于高保真地扩增6kb以内的PCR产物，扩增所得的DNA为平末端，可用于基因克隆、表达及突变分析等分子生物学实验。

• 建议PCR条件(以50μL反应体系为例)
  

  成分	用量	终浓度
  模板	Variable	＜0.5μg
  Forward Primer 10μM	1μL	0.2μM
  Reverse Primer 10μM	1μL	0.2μM
  10×KOD Buffer	5μL	1×
  dNTP Mixture(10mM each)	1μL	0.2mM
  KOD DNA Polymerase	0.25～0.5μL	-
  dH2O	至50μL	-

  
  注意：
  
  • 用无菌PCR级别的水补至终体积50μL。实际操作中计算好需补加水的量后，建议先加水，然后按上述顺序添加其它成分，最后添加KOD DNA Polymerase。充分混匀后，离心数秒使反应混合物沉到管底。然后将反应管置于PCR仪中进行扩增。
    
  • 在冰浴上混合PCR各种成分，防止KOD DNA聚合酶降解引物和模板。
    
  • 高保真KOD对于dNTP纯度要求很高，因此建议用本酶配套的超纯dNTP mix。
• PCR条件的优化
  
  • 质粒或者噬菌体模板：
    模板量5～20ng，循环参数如下表：
    

    Cycling parameters	＜1kbp target DNA	1-2kbp target DNA	3-4kbp target DNA	5-6kbp target DNA
    Step 1	94℃ 2min	94℃ 2min	94℃ 2min	94℃ 2min
    Step 2	94℃ 20sec	94℃ 20sec	94℃ 20sec	94℃ 30sec
    Step 3	Ta 20sec	Ta 20sec	Ta 20sec	Ta 30sec
    Step 4	72℃ 20sec	72℃ 30sec	72℃ 40sec	72℃ 60sec
    Step 5	72℃ 5min	72℃ 5min	72℃ 5min	72℃ 5min
    Repeat step 2-4 for 30-35cycles
    Ta= Tm-5℃

    
    
  • 基因组DNA和cDNA模板：
    基因组DNA模板量为50～100ng，1～2μL cDNA（起始转录用的RNA为500ng），循环参数如下表：
    

    Cycling parameters	＜2kbp target DNA
    Step 1	94℃ 2min
    Step 2	94℃ 20～30sec
    Step 3	Ta 15～20sec
    Step 4	72℃ 20～60sec
    Step 5	72℃ 5min
    Repeat step 2-4 for 30-35cycles
    Ta= Tm - 5℃